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# AGENTS.md — RGC-ADOA 项目
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## 项目概述
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基于 Kang et al., *Science Advances* (2026)（`ref/sciadv.adx7815.pdf`）公开的单细胞数据，对 **OPA1 突变导致的常染色体显性视神经萎缩（ADOA）** 小鼠视网膜进行再分析。文献精读笔记见 `doc/文献精读_Kang2026_ADOA_OPA1.md`。
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### 分析目标
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1. **核心问题**：RGC、Müller 胶质细胞、小胶质细胞（microglia）在缺失/突变 OPA1 后发生什么改变？
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2. **常规分析**：不同细胞类型的差异基因与富集分析，**重点关注这 3 类细胞的 IFN–JAK–STAT 通路是否异常活化**，泛化为炎症通路活化情况分析。
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3. **研究假设**：OPA1 敲除 → 线粒体损伤 →（a）直接影响能量代谢；（b）损伤线粒体激活炎症通路 → 损伤神经元。
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> 注：原文只做了能量代谢轴（ETC/糖酵解/线粒体自噬），**没有分析炎症通路、Müller 胶质细胞和小胶质细胞**——这是本项目的增量空间。
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## 目录约定
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| 目录 | 用途 |
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| --------- | ------------------------- |
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| `data/` | 原始数据 + 重要可复用中间数据（如 h5ad） |
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| `ref/` | 参考文献、软件文档等，**只读** |
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| `doc/` | 分析计划、分析报告、调研报告等 md 文档 |
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| `script/` | 代码、脚本 |
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| `output/` | 脚本输出；**图片默认 PNG，300 ppi** |
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## 代码托管（Gitea）约定
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- **远端**：自托管 Gitea `https://gitea.rainotes.top/rain/RGC-ADOA.git`（**不是 GitHub**），分支 `main`。
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- **不进 git**：`data/`（26G 原始/中间数据）——`.gitignore` 已忽略。多设备接续时 `data/` 需单独 `rsync`/`scp` 传输，其余目录随 `git pull` 同步（见 `README.md`）。
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- **进 git**：`script/`、`doc/`、`ref/`、`output/` 及仓库配置文件（`.gitignore`/`.gitattributes`/`README.md`/`AGENTS.md`）。
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- **提交身份**：`rain <wjs_Rain@126.com>`（已写入仓库本地 config）。
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- **换行符**：`.gitattributes` 设 `* text=auto`，仓库内统一 LF；跨 Windows/Linux 勿手动改动换行符。
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- **服务器存储/性能有限**：新增大体量文件（尤其二进制、大表，>100MB）先确认是否需要进 git，勿误把数据/大文件提交进历史。
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- **提交前自查**：`git status` 确认 `data/` 未被暂存；`git ls-files data/` 应为空。
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- 凭据走 Git Credential Manager，推送无需重复输密码。
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## 数据来源
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- **snRNA-seq**：GEO [GSE292269](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE292269)（BioProject PRJNA1237794）——**已下载**，`data/GSE292269_RAW.tar`（332MB）+ 解压至 `data/GSE292269/{WT,Opa1V291D_S1,Opa1V291D_S2}/`
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- 3 个样本，均为 360 天小鼠全视网膜 pooled nuclei：
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- GSM8855044 — WT（Opa1+/+）
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- GSM8855045 — Opa1V291D_S1
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- GSM8855046 — Opa1V291D_S2
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- ⚠️ GEO 存放的是 **raw feature-barcode 矩阵**（barcodes 各含 110–145 万条，矩阵元数据标注 Cell Ranger 4），**需自行做空液滴过滤**；54,232 features（扩展注释）
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- 探索发现：**WT 文库核数与质量明显低于两个突变样本**（knee plot 见 `output/01_qc/knee_plots.png`），比较时注意
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- 原文每组 n=5 只小鼠 pooled；原始 FASTQ 在 SRA（PRJNA1237794），一般用不到
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- **空间转录组（Visium HD FFPE，280 天）**：**GEO 未收录，原文也未给出 accession，待找**
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- **补充材料已就位**（`ref/`）：`sciadv.adx7815_sm.pdf`（图 S1–S9、表 S1–S4，含表 S3 注释 marker——**无 microglia**）+ `ref/Data files/`（S2 全细胞类型 DEG 表、S3–S12 各细胞类型完整 ORA 富集结果、S1 空间代谢组定量）。预查要点见 `doc/第一轮分析计划_v1.md` §1.1。
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## 计算环境（已实测）
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- Windows 11 + Git Bash；Python **3.14.4**，**scanpy 1.12.4 已装**（scverse 生态为主）
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- **未安装 R** —— 不要写 Seurat/R 脚本；富集分析用 Python 方案（gseapy/decoupler/pathway-enrichment skill）
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- `uv`、`curl` 可用；网络访问 GEO/NCBI FTP 正常
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- 分析主栈：scanpy + anndata；差异表达 pseudobulk 用 pydeseq2；富集/模块打分类 pathway-enrichment skill（gseapy/MSigDB，注意**小鼠基因集**）；视需要 scvi-tools/scvelo
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## 可用 skill（与本项目相关）
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- 单细胞：`scanpy`、`anndata`、`scvi-tools`、`scvelo`
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- 富集：`pathway-enrichment`（ORA/GSEA/模块打分，含 MSigDB/GO/KEGG/Reactome/WikiPathways）
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- 差异表达（pseudobulk）：`pydeseq2`
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- 查库：`gget`、`bioservices`（ID 转换、通路查询）
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- 文献/网络：`exa-search`（**搜索一律走 Exa，不用内置 WebSearch**）、`paper-lookup`
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- 读文献：`pdf2md`（PDF → md）
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- 画图：`scientific-visualization`（出版级）、`matplotlib`、`seaborn`
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- 算力评估：`get-available-resources`（跑大任务前调用）
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## 全局规则要点（来自用户全局 CLAUDE.md）
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- 识图分流：Kimi 系模型直接 Read 图片；DeepSeek 系必须用 `node ~/.claude/skills/vision/vision.js "<图片绝对路径>" "用中文描述"`。
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- 网络搜索一律用 `exa-search` skill，禁用内置 WebSearch。
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- 回复与文档一律用简体中文，技术术语保留英文原文。
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## 报告规则
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- `doc/` 下的分析报告必须以 markdown 图片语法插入脚本生成的 figure，使用**绝对路径**（正斜杠），例如：
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``
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- 每张图紧跟一句话图注，说明结论而不是只描述内容；报告正文中引用过的图必须实际嵌入，不允许只写相对路径或文件名。
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## 数据分析注意事项（再分析时务必记住）
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1. **生物学重复陷阱**：WT 只有 1 个 pooled 样本，突变 2 个——细胞级 Wilcoxon 检验存在严重 pseudoreplication 风险。**核心结论必须以 pseudobulk（样本为单位聚合）+ 谨慎统计为准**，细胞级检验只作探索。
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2. **基因型与批次混杂**：3 个样本 = 3 个独立建库，WT/mutant 之间差异与批次效应不可完全分离，解释时留有余地。
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3. **microglia 稀少**：全视网膜约 1.9 万核中小胶质细胞占比很低（通常 <1%），炎症分析可能面临细胞数不足；需要时放宽聚类分辨率专门捞免疫细胞（P2ry12/Aif1/C1qa 等 marker）。
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4. **snRNA-seq 特性**：核测序中 mito% 指标不适用常规阈值；炎症/即刻早期基因表达与 scRNA-seq 有偏差。
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5. **原文的阴性结果**：ISR（p-eIF2α/ATF4）免疫荧光未见激活——我们做炎症通路时注意与该结果对照叙述。
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