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AGENTS.md — RGC-ADOA 项目
项目概述
基于 Kang et al., Science Advances (2026)（ref/sciadv.adx7815.pdf）公开的单细胞数据，对 OPA1 突变导致的常染色体显性视神经萎缩（ADOA） 小鼠视网膜进行再分析。文献精读笔记见 doc/文献精读_Kang2026_ADOA_OPA1.md。
分析目标
- 核心问题：RGC、Müller 胶质细胞、小胶质细胞（microglia）在缺失/突变 OPA1 后发生什么改变？
- 常规分析：不同细胞类型的差异基因与富集分析，重点关注这 3 类细胞的 IFN–JAK–STAT 通路是否异常活化，泛化为炎症通路活化情况分析。
- 研究假设：OPA1 敲除 → 线粒体损伤 →（a）直接影响能量代谢；（b）损伤线粒体激活炎症通路 → 损伤神经元。
注：原文只做了能量代谢轴（ETC/糖酵解/线粒体自噬），没有分析炎症通路、Müller 胶质细胞和小胶质细胞——这是本项目的增量空间。
目录约定
| 目录 | 用途 |
|---|---|
data/ |
原始数据 + 重要可复用中间数据（如 h5ad） |
ref/ |
参考文献、软件文档等，只读 |
doc/ |
分析计划、分析报告、调研报告等 md 文档 |
script/ |
代码、脚本 |
output/ |
脚本输出；图片默认 PNG，300 ppi |
代码托管（Gitea）约定
- 远端：自托管 Gitea
https://gitea.rainotes.top/rain/RGC-ADOA.git（不是 GitHub），分支main。 - 不进 git：
data/（26G 原始/中间数据）——.gitignore已忽略。多设备接续时data/需单独rsync/scp传输，其余目录随git pull同步（见README.md）。 - 进 git：
script/、doc/、ref/、output/及仓库配置文件（.gitignore/.gitattributes/README.md/AGENTS.md）。 - 提交身份：
rain <wjs_Rain@126.com>（已写入仓库本地 config）。 - 换行符：
.gitattributes设* text=auto，仓库内统一 LF；跨 Windows/Linux 勿手动改动换行符。 - 服务器存储/性能有限：新增大体量文件（尤其二进制、大表，>100MB）先确认是否需要进 git，勿误把数据/大文件提交进历史。
- 提交前自查：
git status确认data/未被暂存；git ls-files data/应为空。 - 凭据走 Git Credential Manager，推送无需重复输密码。
数据来源
- snRNA-seq：GEO GSE292269（BioProject PRJNA1237794）——已下载，
data/GSE292269_RAW.tar（332MB）+ 解压至data/GSE292269/{WT,Opa1V291D_S1,Opa1V291D_S2}/- 3 个样本，均为 360 天小鼠全视网膜 pooled nuclei：
- GSM8855044 — WT（Opa1+/+）
- GSM8855045 — Opa1V291D_S1
- GSM8855046 — Opa1V291D_S2
- ⚠️ GEO 存放的是 raw feature-barcode 矩阵（barcodes 各含 110–145 万条，矩阵元数据标注 Cell Ranger 4），需自行做空液滴过滤；54,232 features（扩展注释）
- 探索发现：WT 文库核数与质量明显低于两个突变样本（knee plot 见
output/01_qc/knee_plots.png），比较时注意 - 原文每组 n=5 只小鼠 pooled；原始 FASTQ 在 SRA（PRJNA1237794），一般用不到
- 3 个样本，均为 360 天小鼠全视网膜 pooled nuclei：
- 空间转录组（Visium HD FFPE，280 天）：GEO 未收录，原文也未给出 accession，待找
- 补充材料已就位（
ref/）：sciadv.adx7815_sm.pdf（图 S1–S9、表 S1–S4，含表 S3 注释 marker——无 microglia）+ref/Data files/（S2 全细胞类型 DEG 表、S3–S12 各细胞类型完整 ORA 富集结果、S1 空间代谢组定量）。预查要点见doc/第一轮分析计划_v1.md§1.1。
计算环境（已实测）
- Windows 11 + Git Bash；Python 3.14.4，scanpy 1.12.4 已装（scverse 生态为主）
- 未安装 R —— 不要写 Seurat/R 脚本；富集分析用 Python 方案（gseapy/decoupler/pathway-enrichment skill）
uv、curl可用；网络访问 GEO/NCBI FTP 正常- 分析主栈：scanpy + anndata；差异表达 pseudobulk 用 pydeseq2；富集/模块打分类 pathway-enrichment skill（gseapy/MSigDB，注意小鼠基因集）；视需要 scvi-tools/scvelo
可用 skill（与本项目相关）
- 单细胞：
scanpy、anndata、scvi-tools、scvelo - 富集：
pathway-enrichment（ORA/GSEA/模块打分，含 MSigDB/GO/KEGG/Reactome/WikiPathways） - 差异表达（pseudobulk）：
pydeseq2 - 查库：
gget、bioservices（ID 转换、通路查询） - 文献/网络：
exa-search（搜索一律走 Exa，不用内置 WebSearch）、paper-lookup - 读文献：
pdf2md（PDF → md） - 画图：
scientific-visualization（出版级）、matplotlib、seaborn - 算力评估：
get-available-resources（跑大任务前调用）
全局规则要点（来自用户全局 CLAUDE.md）
- 识图分流：Kimi 系模型直接 Read 图片；DeepSeek 系必须用
node ~/.claude/skills/vision/vision.js "<图片绝对路径>" "用中文描述"。 - 网络搜索一律用
exa-searchskill，禁用内置 WebSearch。 - 回复与文档一律用简体中文，技术术语保留英文原文。
报告规则
doc/下的分析报告必须以 markdown 图片语法插入脚本生成的 figure，使用绝对路径（正斜杠），例如：- 每张图紧跟一句话图注，说明结论而不是只描述内容；报告正文中引用过的图必须实际嵌入，不允许只写相对路径或文件名。
数据分析注意事项（再分析时务必记住）
- 生物学重复陷阱：WT 只有 1 个 pooled 样本，突变 2 个——细胞级 Wilcoxon 检验存在严重 pseudoreplication 风险。核心结论必须以 pseudobulk（样本为单位聚合）+ 谨慎统计为准，细胞级检验只作探索。
- 基因型与批次混杂：3 个样本 = 3 个独立建库，WT/mutant 之间差异与批次效应不可完全分离，解释时留有余地。
- microglia 稀少：全视网膜约 1.9 万核中小胶质细胞占比很低（通常 <1%），炎症分析可能面临细胞数不足；需要时放宽聚类分辨率专门捞免疫细胞（P2ry12/Aif1/C1qa 等 marker）。
- snRNA-seq 特性：核测序中 mito% 指标不适用常规阈值；炎症/即刻早期基因表达与 scRNA-seq 有偏差。
- 原文的阴性结果：ISR（p-eIF2α/ATF4）免疫荧光未见激活——我们做炎症通路时注意与该结果对照叙述。