RGC-ADOA/doc/第一轮分析计划_v1.md

第一轮分析计划（v1）

日期：2026-09-17 依据：AGENTS.md、doc/文献精读_Kang2026_ADOA_OPA1.md、script/01_explore_raw.py 探索结果 数据：data/GSE292269/{WT,Opa1V291D_S1,Opa1V291D_S2}/（已解压整理为 Cell Ranger 目录结构）

---

0. 数据现状（探索结论，先行事实）

GEO 存放的是 raw feature-barcode 矩阵（非 filtered；矩阵元数据标注 Cell Ranger 4），需自行做空液滴过滤。54,232 个 feature（注释范围大于标准 mm10 参考，利于 lncRNA 等扩展分析）。

样本	基因型	UMI≥500 & 基因≥300 核数	中位 UMI	中位基因数	mt% 中位 / p95
WT	Opa1+/+	3,217	836	505	2.0% / 13.7%
Opa1V291D_S1	V291D/+	10,835	1,255	871	0.7% / 4.1%
Opa1V291D_S2	V291D/+	10,722	1,396	963	0.6% / 5.0%

粗过滤合计 ~2.5 万核，高于原文的 19,315（其过滤更严）。关键观察：

1. WT 文库明显更小、质量更差（核数仅突变样本 1/3，UMI 中位数低 ~40%，mt% 偏高）→ 所有 WT vs Mutant 比较须控制测序深度/质量差异，报告中明示该局限。
2. marker 粗查提示 ambient 污染：P2ry12 在 ~6% 核中检出而 Aif1 仅 ~0.2%、C1qa ~0.8%，不一致 → 低 UMI 核中混入环境 RNA；microglia 判定必须多 marker 共表达（Aif1/C1qa/Tmem119），严禁单 marker。
3. RGC（Rbpms ~9-12%）、Müller（Rlbp1 ~18%、Glul ~40%）丰度符合预期；Gfap <1%（非反应态基线）。

1. 分析目标（承接 AGENTS.md）

• Q1：RGC、Müller、microglia 在 OPA1 突变后的细胞类型特异性改变。
• Q2：各细胞类型差异基因 + 富集；重点 IFN–JAK–STAT，泛化至炎症通路。
• 假设检验框架：H1 代谢直接受损（复现原文 ETC/糖酵解下调，作阳性对照）；H2 炎症轴改变（mt 损伤→mtDNA/ROS→cGAS-STING/NLRP3→IFN/JAK-STAT）。⚠️ 依据补充材料预查（§1.1），H2 的方向需双向表述——ISG 可能是下调（免疫麻痹/全局转录抑制）而非激活，分析必须能区分这两种情形。

1.1 补充材料清单与预查发现（2026-09-17 更新）

已到位于 ref/：sciadv.adx7815_sm.pdf（图 S1–S9、表 S1–S4）+ ref/Data files/（12 个 Excel）。

文件	内容	用途
表 S3（sm.pdf）	9 类细胞注释 marker	注释对齐基准；注意无 microglia marker
S2. snRNAseq-DEG_All_Celltype.xlsx	11 个 sheet：All_type（14,011 行汇总）+ 每细胞类型 DEG 全表（Gene/avg_log2FC/pct/p_val，未校正）	与我们 DE 结果做基因级一致性对照
S3–S12. Pathway_*.xlsx	每细胞类型 WikiPathways + Reactome 的完整未过滤 ORA 结果（clusterProfiler 原始输出）	通路级交叉验证；可重画富集图
S1. Spatial_Metabolomic_*.xlsx	MALDI 靶向定量数值	ATP/AMP/G6P 数值旁证

预查发现（直接影响分析设计）：

1. 作者注释体系中没有 microglia：10 个 cluster = Rod/Cone/RGC-1/RGC-2/Amacrine/Müller/Uveal/Bipolar/Horizontal/Pericyte。microglia 大概率散落于 "Uveal/other" 或因数量过少未成群 → 我们的免疫细胞捕捞步骤是硬性需求。
2. RGC-2 的 Reactome 显著通路（adj<0.1 共 202 条）中包含炎症条目，原文从未讨论：Antiviral mechanism by IFN-stimulated genes（adj=0.026）、Interferon Signaling（adj=0.081）、Dectin-1/NF-κB、NIK→noncanonical NF-κB、FCERI-NF-κB——我们的切入点在作者自己的数据里就有信号。
3. 但方向是下调：S2 表中 Ifit2、Stat1、Ifnar1/2、Jak1/2、Ifit3、Xaf1 等在 RGC-1/RGC-2/Müller 均为 DOWN（p<0.01）。IFN 通路富集由下调 ISG 驱动 → 需鉴别"免疫抑制/全局转录塌陷"与"通路特异性调控"。
4. Müller 在作者分析中几乎无通路级信号（Reactome 0 条显著），但 Apoe 是其头号上调基因（log2FC +1.33）——反应性胶质化信号可能真实存在但被其噪声大的细胞级 DE 淹没，适合用模块打分深挖。

2. 分析流程

Step 1 — 质控与过滤 script/02_qc_filter.py

• 按样本分别定阈值（knee 拐点 + 绝对下限 UMI≥500、基因≥300 起步，依 QC 图微调）；mt% 阈值放宽（核测序，WT 用更严的 p95 控制 debris）。
• 双联体：scrublet（每样本独立）。
• 可选：ambient RNA 校正（cellbender 若算力允许；否则以多 marker 门控规避）。
• 产出：data/01_filtered.h5ad；output/02_qc/（小提琴图、散点、阈值表）。

Step 2 — 归一化、整合与聚类 script/03_integrate_cluster.py

• 归一化 + log1p（scanpy 默认；平行试 scTransform 风格的 Pearson 残差可选）；HVG ~3000；PCA。
• 批次整合谨慎处理：批次与基因型完全混杂（WT 单样本），整合可能过校正掉真实生物信号。策略：Harmony/scVI 按 sample 整合用于聚类与注释；所有定量比较在原始（仅归一化）表达空间进行。
• Leiden 多分辨率（0.4/0.8/1.2）+ UMAP。
• 产出：data/02_clustered.h5ad；output/03_cluster/。

Step 3 — 细胞类型注释 script/04_annotate.py

• 经典 marker 手工注释，基准用原文表 S3（已存 ref/sciadv.adx7815_sm/：Rod—Cnga1/Gnat1/Rho/Sag 等；Cone—Arr3/Gnat2/Opn1mw；RGC—Rbpms/Slc17a6/Thy1；Amacrine—Gad1/Gad2/Tfap2b；Müller—Rlbp1/Slc1a3；Uveal—Gpnmb/Tyr；Bipolar—Grm6/Prkca/Cabp5；Horizontal—Lhx1/Onecut2/Prox1；Pericyte—Pdgfrb/Rgs5）。
• microglia 专项捕捞（作者未注释该类）：以 Aif1/C1qa/C1qb/Tmem119/P2ry12/Hexb 共表达为门控，先全数据低分辨率标记候选，再取出重聚类确认；同时检查其是否被作者并入 "Uveal/other"。
• 可选自动化辅助：CellTypist（Python）/参考映射（scANVI，参照已发表小鼠视网膜 atlas）。
• RGC 亚群细分：单独取 RGC 重聚类，复现原文 RGC-1/RGC-2，并对标已知 RGC 亚型 marker（Opn4/ipRGC 等）。
• 产出：data/03_annotated.h5ad；注释依据表 output/04_annotation/marker_table.csv。

Step 4 — 细胞组成分析 script/05_composition.py

• 各细胞类型在 WT vs Mutant 的比例变化（ stacked bar + 每样本点）。
• 注意 n=1 vs n=2，仅作描述性展示；如需统计，用 S1/S2 间变异作噪声参照，不做正式检验。

Step 5 — 差异表达（双层策略）script/06_de.py

• 探索层：细胞级 Wilcoxon（scanpy rank_genes_groups），明确标注 pseudoreplication 局限，仅用于发现候选。
• 核心层 — 方向一致性策略（应对 WT 无重复）：
  1. pseudobulk（sample × celltype 求和）→ 分别算 S1 vs WT、S2 vs WT 的 log2FC；
  2. 保留两次比较方向一致且细胞级探索层也一致的基因；
  3. S1 vs S2（同基因型）作阴性校准，估计批次噪声基线，剔除在 S1-S2 中同样"差异"的基因；
  4. pydeseq2 仅用于 LFC shrinkage 与可视化，不报告正式 P 值（WT n=1 无法估计组内方差），报告中如实说明。
• 与作者 DEG 表交叉验证：将各细胞类型 log2FC 与 S2. snRNAseq-DEG_All_Celltype.xlsx 做基因级相关（Spearman）与方向一致率，输出对照表；分歧大的细胞类型需排查注释映射差异（尤其其 "Uveal" 与我们的 microglia 捕捞）。
• 产出：每细胞类型 DEG 表 output/06_de/*.csv；火山图/MA 图；作者对照一致性表。

Step 5.5 — 全局转录抑制鉴别（新增，回应 §1.1 发现 3）script/06b_global_shift.py

• 检验 RGC（尤其 RGC-2）是否存在整体性转录下调而非通路特异调控：比较各细胞类型 × 基因型的每核总 UMI/检出基因数分布；housekeeping 基因集（如 Actb/Gapdh 慎用，改用 ERCC 等价物/HRT atlas 管家基因）log2FC 分布；DEG 中 UP/DOWN 数量比。
• 若存在全局下调，所有"通路下调"结论需以相对其他细胞类型的富集特异性表述，且 IFN/ISG 下调解读为全局塌陷的一部分还是独立事件，需用模块打分 z 值与全局背景比较。

Step 6 — 炎症与通路分析（核心创新点）script/07_inflammation.py

• 模块打分（decoupler / AUCell 路线，Python）：MSigDB Hallmark（小鼠版）——INTERFERON_ALPHA_RESPONSE、INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、IL6_JAK_STAT3_SIGNALING、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB、COMPLEMENT、INFLAMMATORY_RESPONSE；Reactome——interferon signaling、cytokine signaling、cGAS-STING、NLRP3 inflammasome；另加线粒体应激相关基因集（UPRmt、mtDNA release）与 Müller 反应性胶质化基因集（Gfap/Vim/Serpina3n/Apoe/Lcn2 等）和 microglia 激活态基因集（DAM：Apoe/Spp1/Lpl/Trem2；稳态：P2ry12/Tmem119/Hexb）。
• 按细胞类型 × 基因型比较打分分布；重点 RGC / Müller / microglia。
• 双向解读：作者数据显示 ISG 下调（§1.1 发现 3），分析时同时报告"激活"与"抑制"证据，避免确认偏误；与 Step 5.5 的全局背景联动解释。
• GSEA preranked：以 Step 5 的一致性 log2FC 排序列表做 gseapy prerank（Hallmark + Reactome 小鼠集）。
• IFN–JAK–STAT 专项：Ifnb1/Ifnar1/Ifnar2、Stat1/Stat2/Stat3、Irf7/Irf9、ISG（Isg15、Ifit1/2/3、Mx1/2、Oas1a、Cxcl10）逐基因表达热图 + 在每类细胞中的检出率；并与作者 S2 表中同基因 log2FC 并排对照。
• 产出：output/07_inflammation/（打分热图、ridge/violin 图、GSEA 表与点图）。

Step 7 — 阳性对照：复现原文能量代谢结论 script/08_replicate_metabolism.py

• 在 RGC（及 RGC-1/RGC-2 亚群）检验 ETC、Complex I biogenesis、糖酵解基因下调是否复现；基准直接用作者补充表（S10 RGC-2 通路表的显著条目与其基因成员），而非仅对照正文图。
• 同时检查线粒体自噬/自噬基因集（原文 fig. S5：pyruvate metabolism & TCA、mitophagy、autophagy，adj.P=0.029/0.0075/0.0002）。
• 若复现失败需先排查 QC/注释差异，再下任何炎症结论——这是整个再分析的校准锚点。

Step 8（可选，视前期结果）— 细胞通讯 script/09_cci.py

• liana（Python 版 CellPhoneDB/CellChat 类）推断 RGC↔Müller↔microglia 的炎症配受体轴（如 IL-6、CXCL10-CXCR3、补体 C3-C3aR）。
• 为"线粒体损伤→胶质炎症→神经元损伤"链条提供旁证。

3. 预期产出清单

内容	位置
QC 报告（阈值、双联体检出率、最终核数）	output/02_qc/
UMAP（样本/基因型/细胞类型/注释 marker）	output/03_cluster/
注释 marker 证据表	output/04_annotation/
组成变化图	output/05_composition/
各细胞类型 DEG 表 + 图	output/06_de/
炎症模块打分与 GSEA 结果	output/07_inflammation/
能量代谢复现对照	output/08_replication/
第一轮分析报告（md，汇总图文与结论）	doc/第一轮分析报告.md

所有图片 PNG、300 ppi；中间数据 h5ad 存 data/。

4. 风险与预案

风险	预案
WT 文库质量差/核数少 → 稀有细胞类型在 WT 中缺失	组成与 DE 注明不确定性；必要时放宽 WT 阈值并做敏感性分析
microglia 核数过少（预期 <1%，可能仅几十~一百核/样本）	不做细胞级 DE，改用模块打分 + 检出率比较；全数据集中先低分辨率捞出所有免疫细胞再精细重聚类
批次=基因型混杂无法统计分离	方向一致性 + S1-vs-S2 阴性校准；结论措辞限定"提示/一致于"而非"证明"
注释与原文不一致	以下载的 table S3 为准对齐；差异处记录并解释
空转数据仍缺	本轮分析不依赖空转；若获得，后续轮次做空间验证

5. 执行顺序与优先级

1. P0：Step 1–4（QC→聚类→注释→组成）——后续一切的基础。
2. P0：Step 7 阳性对照复现——先验证管线可信度。
3. P1：Step 5–6（DE + 炎症通路）——回答 Q1/Q2。
4. P2：Step 8 细胞通讯——加分项。

6. 决策记录（2026-09-17 grill-me 确认）

决策点	结论
本轮范围	仅 P0（QC→聚类→注释→组成→代谢结论复现），P1/P2 下一轮
QC 过滤	两阶段：先简单阈值（knee + UMI/基因 + mt%，scrublet 去双联体）；若 ambient 明显干扰再补 cellbender 敏感性对比
WT 文库质量差	全量分析 + 匹配敏感性对照：定量比较时对 S1/S2 下采样至 WT 规模做核对，主结果用全量
批次整合	Harmony（按 sample），仅用于聚类/注释；定量比较用原始归一化表达
RGC 亚群	只复现 RGC-1/RGC-2，亚型身份粗标注，不引入外部 atlas
microglia 不足时	底线交付 = 模块打分 + 关键基因检出率，不做细胞级 DE
交付形式	每步一个 .py 脚本 + doc/第一轮分析报告.md，图片 PNG 300 ppi
报告侧重	机制论证为主（代谢 vs 炎症的时序与细胞类型归属）

第二轮裁决（2026-09-17，P0 完成后 grill-me 确认）

悬案	裁决
Müller 全面上调：真激活 vs 深度假象	P1 先做下采样敏感性分析：S1/S2 下采样至 WT 核数与深度后重算模块分，上调保留才算真信号
RGC-2 类似群定义（循环论证问题）	改用作者 RGC-2 DEG 签名（数据文件 S2 中 RGC-2 高表达基因）打分定义，弃用"WT ETC top30%"
H2 炎症轴重点	胶质为主：Müller/microglia 的反应性胶质化 + IFN/补体模块 + DAM/稳态转换；RGC 本体只做 ISG 逐基因核查（预期抑制，与全局抑制鉴别）
RGC_lowETC 上调：代偿 vs 幸存者偏差	并列呈现不裁决，留给实验（早期时间点）回答
cellbender 时机	维持两阶段：仅当下采样裁决显示 ambient/深度影响关键结论时启动
Visium HD 空转	搁置，不阻塞 P1/P2；机会性查找

第三轮裁决（2026-09-17，P1 完成后 grill-me 确认）

悬案/新问题	裁决
阳性对照 ETC/CI"未复现"	实为完整复现：P0 的"ETC 持平"是 ETC 分位法循环定义 artifact，签名法下 RGC2-like 的 ETC −0.30、CI −0.28、糖酵解 −0.72、自噬 −0.03 全部下调，pseudobulk 基因级 ETC 中位 −0.70。修订 P0/P1 报告
RGC-2 定义与比例（签名法 5.8:1 vs 作者 1:1，WT 仅 7 核）	接受签名法并标注低估：签名法是最保守下界（突变 RGC-2 身份基因丢失被算入 RGC1-like），方向不反、效应量被低估；RGC2-like 的 7 WT 核作已知硬伤
microglia 结论极弱（WT 8 核 + 深度 2 倍污染）	接受方向性、重心转 Müller：microglia 作支持性线索（Apoe↑ 逆深度 + DAM/稳态方向），主结论靠 Müller（183 WT 核）与 RGC；留待更大样本/空转
cellbender 是否启动	不启动（两阶段终止）：P1 已证主要 confounder 是深度（WT 非杆核 2 倍）而非 ambient；microglia 用多 marker 门控已规避 ambient；无 GPU 成本高
Müller 下采样裁决的方法学错位	只改表述、不重做：原假设"深度假象"方向反了（WT Müller 深度 3633 vs 突变 1802），下采样实际只匹配核数；但结论"ETC 真、其余假"仍成立，且 WT 深度优势下 ETC 仍上调 = 真信号甚至被低估
WT 非杆核深度 2 倍的根本原因	待查（GEO reads/建库细节），不阻塞结论（已用 median-of-ratios 校正）；并入 P2 confounder 加固
P2 优先级	先修报告（补 ETC 完整复现 + 修正 Müller 下采样表述 + 写入本轮裁决）→ 再 liana 细胞通讯