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第一轮分析报告（P0：QC → 注释 → 组成 → 阳性对照复现）
日期：2026-09-17 ｜ 数据：GSE292269（3 样本，360 天小鼠视网膜 snRNA-seq） 管线：
script/02_qc_filter.py→03_integrate_cluster.py→04_annotate.py→05_composition.py→08_replicate_metabolism.py决策依据：doc/第一轮分析计划_v1.md§6
1. 数据质控
GEO 存放的是 raw 矩阵（含百万级空 barcode），我们自行完成了空液滴过滤。
| 样本 | 基因型 | 过滤后核数 | 中位 UMI | 中位基因数 | mt% 中位 |
|---|---|---|---|---|---|
| WT | Opa1+/+ | 2,944 | 868 | 529 | 1.8% |
| Opa1V291D_S1 | V291D/+ | 10,744 | 1,267 | 881 | 0.7% |
| Opa1V291D_S2 | V291D/+ | 10,582 | 1,412 | 972 | 0.6% |
- 合计 24,270 核 × 24,007 基因（阈值：UMI≥500、基因≥300、mt%<10%；原文为 19,315 核，量级一致）。
- scrublet 仅检出 0.0–0.1% 双联体（自动阈值在低复杂度核数据上偏保守，作为已知局限记录）。
- ⚠️ WT 文库显著小于突变样本（核数 1/3.6，UMI 中位数低 ~35%），且 Rho 在所有 cluster 中检出率 >94%——ambient RNA 污染重；后续若做精确定量需 cellbender 校正复核（决策记录 #2 第二阶段）。
图 1：三个样本的 knee plot——WT 拐点靠前（~2–3k 核），突变样本靠后（~6–10k 核），直观呈现文库规模差异。
图 2：过滤后 QC 指标小提琴图——三组样本的 UMI/基因数均呈双峰，低峰主要是杆细胞核（其转录本量天然小：WT 中 Rod 中位基因数 407 vs 非 Rod 2,254，突变样本同样成立），因此双峰主要反映细胞类型组成而非单纯质量问题；WT 的真正特异之处是 mt% 拖尾明显更厚（低质核占比更高）。
2. 聚类与注释
Harmony（按 sample）整合后 WT/突变细胞在 UMAP 上充分混合（下图），未见批次驱动的孤立群。leiden_0.8（52 clusters）+ 补充 PDF 表 S3（Cell markers for cell type annotation）marker 打分注释：
图 3：UMAP 按基因型着色——WT（橙）散在各 cluster 内部，说明聚类结构由细胞类型而非批次主导。
图 3b：UMAP 与 tSNE 降维可视化对照（均以 Harmony 校正 PCA 为输入，tSNE perplexity=30）。两种嵌入的分群结构一致（左列按细胞类型着色，14 类清晰分离），印证聚类结果稳健、不依赖降维算法；差异仅在展示形态——tSNE 把高丰度的 Rod 大群压缩到中心（其固有特性，中心大团块为 Rod），UMAP 更舒展、簇间关系更清楚。右列按基因型着色，WT（蓝，n=2944）散落在各簇内部、无独立批次群，进一步确认聚类由细胞类型而非文库批次主导。⚠️ 二者均为 2D 可视化投影，不参与聚类（Leiden 在 PCA 空间）也不参与任何下游定量，因此原文 tSNE 与我们 UMAP 的选择差异不影响结论。
图 4：注释证据 dotplot——RGC（cluster 36/38/46：Rbpms/Slc17a6/Thy1）、microglia（cluster 31：Aif1/C1qa/C1qb/Tmem119/Hexb）等marker 信号清晰；注意 Rho 列几乎全红，是 ambient 污染的直接证据。
图 4b：完整表 S3 marker（32 基因全部在我们数据中检出，无一缺失）+ 本项目补充 marker（带 + / * 后缀的分组，覆盖 S3 未包含的 microglia/astrocyte/内皮/少突）。可见部分官方 marker（Cnga1、Cngb1、Rp1、Ush2a、Cngb3、Slc6a5、Cabp5、Lhx1）在本数据中检出率低、点稀——这是核测序深度所致，不影响主注释（打分用多基因联合）；作者的使用方式是把整张 S3 喂给 SCtype 自动注释工具做 cluster 级富集打分，与我们的手工打分殊途同归，且我们对 microglia 等类型的覆盖比 S3 更全。
| 细胞类型 | V291D | WT | 备注 |
|---|---|---|---|
| Rod | 7,866 | 1,773 | |
| Muller | 2,389 | 183 | |
| Amacrine | 2,360 | 189 | |
| RGC | 942 | 69 | cluster 36/38/46，Rbpms 检出 95.5% |
| Bipolar | 1,426 | 106 | |
| Horizontal | ~1,135 | ~80 | 部分 cluster 低信度 |
| Cone | 1,208 | 99 | |
| Oligodendrocyte | 978 | 58 | 疑视神经混杂 |
| Pericyte / Endothelial | 898 / 603 | 93 / 55 | |
| Microglia | 132 | 8 | cluster 31，Aif1/C1qa/C1qb/Tmem119/Hexb 全阳性——作者未注释该类 |
| Astrocyte | 90 | 15 | |
| Uveal_Melanocyte | 669 | 53 | 对应作者的 "Uveal" |
| LowConf（剔除） | 1,911 | ~240 | margin<0.5 的 7 个 cluster，其中 cluster 2（601 核）经核查为低复杂度混合群（Rbpms 检出仅 13.6%），正确排除 |
- microglia 捕捞结果：独立 cluster 31 共 140 核（多 marker 共表达验证 69/140 通过 ≥3 marker 门控）；WT 仅 8 核，按决策记录 #6，microglia 只能做模块打分 + 检出率的描述性分析，不做 DE。
3. 细胞组成（描述性，n=1 vs n=2）
- ⚠️ 组成分析受文库质量严重混杂：WT 中 Rod 占 66.9%，突变样本仅 35–49%（低复杂度 WT 文库优先回收了高表达少数基因的杆细胞核），导致其他细胞类型比例在突变中"被动膨胀"。RGC 占比 2.6%→4.5–5.5% 的"升高"是假象。
- 以非杆细胞为底数重新计算：RGC 占比 WT 7.9% vs 突变 8.5–8.8%，基本稳定——360 天时残存 RGC 池的转录组构成未崩。
- Microglia：0.30% (WT) vs 0.60–0.81%（突变），非杆底数校正后 0.91% vs 1.17–1.25%——突变中微升，方向符合"胶质增生"预期，但 WT 基数太小（8 核），仅作参考。
图 5：各样本细胞组成堆叠图——WT 被 Rod（底部大色块）主导，是文库质量差异的直接体现。
图 6：WT vs 突变各细胞类型比例变化——连线斜率主要由 Rod 占比差异驱动，解读需以非杆底数校正为准。
4. 阳性对照：原文能量代谢结论复现
方法：作者数据文件 S10（snRNAseq-Pathway_RGC2.xlsx）leading-edge 基因集（ETC 33 基因、CI biogenesis 26、糖酵解 14）+ Rpl/Rps 核糖体集 + 线粒体自噬集，模块打分比较；RGC 按 WT ETC 分 top30% 阈值分为 highETC（≈原文 RGC-2，WT 仅 21 核）与 lowETC（≈RGC-1）。
| 模块 | RGC_highETC（≈RGC-2） | RGC_lowETC（≈RGC-1） | Müller |
|---|---|---|---|
| ETC | 持平 | ↑ | ↑ |
| CI biogenesis | 持平 | ↑ | ↑ |
| 糖酵解 | ↓（复现 ✓） | ↑ | ↑ |
| 核糖体蛋白 | 持平 | ↑ | ↑ |
| 线粒体自噬/自噬 | ↓（复现 ✓） | 持平/↑ | 持平 |
基因级一致性：作者 RGC-2 显著下调基因（数据文件 S2，p<0.001, log2FC<−0.5，n=1,125）与我们 RGC_highETC 的近似 log2FC 方向一致率 85.5%——强复现。
图 7：各模块分每样本中位值（黑=WT，红/橙=两突变样本）——高能 RGC 中糖酵解与线粒体自噬下调（复现原文），Müller 各模块全面上调（意外发现）。
明细：output/08_replication/module_score_comparison.csv、genelevel_concordance_RGChighETC.csv。
复现结论
⚠️ P1 纠正（重要）：本节"ETC/CI 未复现"的判断已被 P1 推翻，是"按 ETC 高低分位定义 RGC-2"的循环定义 artifact。P1 改用作者 DEG 签名定义 RGC-2 后，RGC2-like 的 ETC −0.30、CI biogenesis −0.28、糖酵解 −0.72、线粒体自噬 −0.03 全部下调，pseudobulk 基因级 ETC 中位 log2FC 更达 −0.70（82% 下调）——即作者的代谢结论（ETC+CI+糖酵解+自噬协同下调）完整复现。详见
doc/第一轮分析报告_P1.md§2。
- 部分复现（P0 阶段性）：糖酵解与线粒体自噬在高能 RGC 中下降（原文两个标志性结论），基因级方向一致率高 → 管线可信；ETC/CI 在 ETC 分位法下"未复现"系循环定义所致，见上方纠正。
- 意外发现——Müller 全面上调：突变 Müller 的 ETC、CI、核糖体、糖酵解模块全部升高，与 RGC 的抑制形成镜像，符合"反应性胶质细胞代谢重编程"。结合作者 DEG 表中 Müller 头号上调基因 Apoe，Müller 反应性激活是 P1 阶段值得深挖的方向。
- RGC_lowETC 各模块普遍上调：低能 RGC 可能处于代偿状态，与"RGC-2 选择性受累"叙事兼容。
5. 对研究假设的初步回应
- H1（代谢直接受损）：✅ 支持，且呈现细胞类型分化——受损集中在高能 RGC（糖酵解/自噬下调），Müller 反而代谢上调。
- H2（炎症轴）：⏸️ 本轮尚无直接证据。关键提醒：作者补充表中 RGC-2 的"IFN/NF-κB 富集"经我们核查，驱动基因实为微管/翻译/蛋白酶体等通用看家机器，非真 ISG（真 ISG 如 Ifit2/Stat1/Ifnar 在其数据中是下调的）——P1 做炎症分析时绝不能照搬通路名，必须落到具体 ISG 基因。
- 机制链条的雏形：OPA1 缺陷 → 高能 RGC 糖酵解/自噬代偿失败（H1 直接打击）→ Müller/microglia 反应性改变（H2 待证，microglia 比例微升 + Müller 代谢激活为间接线索）。
6. 已知局限
- WT 单样本、基因型与批次混杂——所有比较为方向性证据，无正式统计推断。
- WT 文库小且质量低，WT RGC 仅 69 核、WT microglia 仅 8 核——稀有类型比较功效极低。
- Ambient RNA 污染明显（Rho 普遍检出），低表达基因的检出率比较需慎重。
- 模块打分（scanpy score_genes）与作者的 ORA 框架不完全等价，ETC 未复现部分是方法学差异还是真阴性待 P1 用 pseudobulk 复核。
7. 下一步（P1 建议）
- pseudobulk DE（方向一致性策略：S1 vs WT ∩ S2 vs WT，S1 vs S2 阴性校准），重点 RGC_highETC 与 Müller。
- Müller 反应性胶质化专项：Gfap/Vim/Serpina3n/Apoe/Lcn2 模块 + 代谢激活表型确认。
- IFN–JAK–STAT 落到具体基因（ISG 清单逐基因 + 检出率），鉴别全局抑制 vs 通路特异。
- microglia：模块打分（DAM/稳态/IFN）+ 检出率比较，不做 DE。
- 如 ambient 影响关键结论，补 cellbender 复核（决策记录 #2 第二阶段）。