19 KiB
第一轮分析报告 — P1（下采样裁决 → DE → 炎症通路）
日期：2026-09-17 ｜ 数据：GSE292269（3 样本，360 天小鼠视网膜 snRNA-seq） 管线：
script/09_muller_downsample.py→10_rgc2_signature.py→11_pseudobulk_de.py→12_inflammation_modules.py→13_isg_check.py→14_global_shift.py→16_gsea_prerank.py→17_ifn_heatmap_ma.py决策依据：doc/第一轮分析计划_v1.md§6 第二/三轮裁决；本文是doc/第一轮分析报告_P0.md（P0）的延续。
0. 一个必须先讲的方法学发现：WT 文库"质量差"是误读
P0 曾按"全数据中位 UMI"（WT 868 vs 突变 1266/1412）判断 WT 文库质量差。P1 分细胞类型核查后，真相相反：
| 细胞类型 | WT 中位 UMI | S1 中位 UMI | WT/S1 |
|---|---|---|---|
| RGC | 12,167 | 4,497 | 2.71 |
| Horizontal | 8,756 | 3,376 | 2.59 |
| Amacrine | 7,457 | 2,920 | 2.55 |
| Muller | 3,633 | 1,802 | 2.02 |
| Rod | 669 | 573 | 1.17 |
- WT 的每个非杆细胞核深度都是突变核的 ~2 倍；唯一例外是杆细胞（接近 1.0）。
- 全数据中位 UMI 被杆细胞占比主导：WT 杆核占 60.2%，突变仅 43%/31%。杆核天然低 UMI（~600），把 WT 中位数拉低，造成"WT 质量差"的错觉。
- 真实情况是：WT 文库组成极度偏向杆细胞，但非杆核的测序深度反而更高（或突变文库非杆核被稀释）。
对下游的直接影响：任何检出率（detection rate）比较都被这个 2 倍深度差污染——WT 深度高 → 检出更多基因 → 突变"检出率下降"可能是假象。P1 因此只信两类指标：① score_genes 模块分（对照基因校正，深度稳健）；② median-of-ratios 归一化后的 pseudobulk LFC。检出率仅在方向逆深度（突变低深度反而检出更高）时才算证据。
1. P1-① Müller"全面上调"裁决：只有 ETC 是真信号
方法：突变 Müller 随机抽至 183 核（=WT 核数）后重算 5 个代谢模块分，5 个随机种子重复；RGC_highETC 的糖酵解下调作阳性对照（验证方法功效）。
| 模块 | 全量 delta（S1/S2） | 下采样后（S1/S2） | 裁决 |
|---|---|---|---|
| ETC | +0.127 / +0.118 | +0.100 / +0.095 | 保留（真） |
| CI biogenesis | +0.093 / +0.072 | −0.006 / −0.002 | 归零 |
| 糖酵解 | +0.132 / +0.113 | −0.019 / −0.024 | 转负 |
| 核糖体 | +0.075 / +0.045 | −0.022 / −0.022 | 转负 |
| 线粒体自噬 | −0.005 / +0.001 | +0.045 / +0.033 | 不稳定 |
阳性对照：RGC_highETC 糖酵解 −0.138 → −0.159（下采样后更强）→ 方法功效足够，裁决可信。
图 8：Müller 各代谢模块全量（斜线半透明）vs 下采样后（实色，5 种子均值±SD）的 Δ 模块分——只有 ETC 上调在下采样后保留，其余模块的"上调"随核数缩水归零；右侧 RGC_highETC 糖酵解下调下采样后更强，证明该方法能检出真信号。
裁决结论：Müller 的"全面上调"大部分是核数少 + 小效应的假象，唯一稳健的是 ETC 上调（+0.10 保留）。这与"反应性胶质化代谢重编程"的叙事需要收窄——Müller 的激活是炎症/胶质化程序（见 §4），不是线粒体呼吸链的全面上调。⚠️ 补充：裁决的原假设"突变深度高→假象"方向是反的（WT Müller 深度其实更高，见 §0），因此下采样实际校正的是核数而非深度——这反而强化了结论：ETC 上调在 WT 深度优势之下仍存在，是真信号甚至可能被低估。
2. P1-② RGC-2 重定义：作者签名打分法（弃用 ETC 分位循环定义）
签名 = 作者 S2 表中 RGC-2 在 WT 中检出率 ≥0.5 且比 RGC-1 高 ≥0.25 的 top 100 基因（只用 WT 检出率差，不用疾病 DE 信息，避免"用疾病信号定义疾病组"的循环）。分类器 = score(RGC2签名) − score(RGC1签名)。
- 结果：RGC2-like = 141 突变 + 7 WT（WT 太少，标记低功效）；RGC1-like = 801 突变 + 62 WT。
- 代谢模块分（签名法）在 RGC2-like 全部下调，完整复现作者代谢结论：
| 模块 | RGC2-like ΔS1/ΔS2 | RGC1-like ΔS1/ΔS2 |
|---|---|---|
| ETC | −0.299 / −0.257 | +0.123 / +0.107 |
| CI biogenesis | −0.283 / −0.252 | +0.089 / +0.081 |
| 糖酵解 | −0.721 / −0.650 | +0.118 / +0.153 |
| 线粒体自噬 | −0.034 / −0.035 | +0.024 / +0.034 |
（对照：P0 的 ETC 分位组糖酵解仅 −0.14/−0.10，签名法放大约 5 倍；ETC/CI 也从 P0 的"持平"转为下调——P0 的"ETC 未复现"是循环定义 artifact，见 P0 报告 §4 纠正。）
- 基因级方向一致率（作者 RGC-2 显著下调基因 vs 我们 RGC2-like）：88.1%（P0 为 85.5%）；pseudobulk 基因级 ETC 中位 log2FC 达 −0.70（82% 下调）。
图 9：左——签名差分布（黑 WT/红突变）；中——签名分组与 P0 ETC 分组的重叠；右——新分组下代谢模块 Δ 分：RGC2-like 的 ETC/CI/糖酵解/自噬全部下调（红线），RGC1-like 反而上调（粉线），与"RGC-2 选择性受累"完全对齐。
结论：签名法成功分离出真正的 RGC-2，ETC、CI biogenesis、糖酵解、线粒体自噬全部下调——作者的能量代谢结论（含原文 adj.P<10⁻⁵ 的 ETC 下调）完整复现，效应量比 ETC 分位法放大约 5 倍，且不依赖"先按 ETC 分位再验证 ETC"的循环。固有局限：RGC-2 的身份基因（微管/ETC/核糖体）恰是疾病中被下调的基因，突变细胞里"保留身份"的个体偏向较健康者，会低估效应量；WT 仅 7 核仍是硬伤（已按第三轮裁决接受签名法为最保守下界）。
3. P1-③ pseudobulk DE：方向一致性 + 阴性校准
方法：每 样本×细胞组 counts 求和 → median-of-ratios（DESeq2 式 size factor）归一化 → LFC_S1、LFC_S2、LFC_null(S2−S1)；一致基因需 两样本同向、|LFC|≥0.5、阴性校准 |LFC_null| 小于两次生物 LFC、零检出守卫（防深度不对称假 UP）。
与作者 DEG 表交叉验证（Spearman ρ 与作者显著基因方向一致率）：
| 组 | Spearman ρ | 作者显著基因方向一致率 |
|---|---|---|
| Cone | 0.948 | 0.994 |
| RGC1-like | 0.829 | 0.988 |
| Pericyte | 0.813 | 0.988 |
| Muller | 0.773 | 0.911 |
| Uveal | 0.734 | 0.958 |
| RGC2-like | 0.671 | 0.954 |
图 10：我们的 pseudobulk LFC vs 作者细胞级 avg_log2FC（红=我们判定一致的基因）——Cone/RGC1 高度一致（管线可信）；Muller 的散点明显右偏（大量突变上调基因在作者侧也被上调，只是作者细胞级 DE 把它们判为"不显著"）。
两个关键发现：
- Muller 的上调基因是真实且被作者漏掉的：我们 1690 个一致 UP 基因中，作者侧 91.7% 也是上调（均值 +0.92），只是作者细胞级 DE（噪声大）把它们多数压到阈值之下。Muller 头号上调 Apoe 我们 LFC +1.35/+0.93，作者 +1.33——完全一致。说明 P0 观察到的"Müller 反应性激活"有 pseudobulk 支撑。
- 我们各细胞类型 UP/DOWN 比全部 >1（1.2–3.4，突变上调占优），而作者 RGC-2 的比是 0.00（几乎全下调，1171 下调 vs 2 上调）。这个反差正是 §5 全局转录的关键线索。
图 10b：Müller（左）与 RGC2-like（右）的 MA 图（红=一致上调，蓝=一致下调）——代谢基因呈现清晰的镜像：Cox7b/Gapdh/Ndufs3/Uqcrc2（ETC/糖酵解）在 Müller 上调（红）而 RGC2-like 下调（蓝）；Apoe/Clu（胶质化 marker）两图均上调。这是 H1"RGC 代谢下调 vs Müller 代谢上调"的直接可视化。
图 10c：细胞级 Wilcoxon（灰，探索层）与 pseudobulk（青）的 UP/DOWN 方向偏斜对照——Müller 细胞级给出 9 UP / 48 DOWN（几乎全下调），而 pseudobulk 给出 1690 UP / 769 DOWN。细胞级的"全下调偏斜"正是作者（Seurat 细胞级 DE）得到"1171↓ vs 2↑"的同源 artifact；我们改用 pseudobulk + median-of-ratios 后才还原出"突变上调占优"的结构化改变。
4. P1-④ 炎症模块打分（胶质为主）
12 个模块：IFN-α/γ、IL6-JAK-STAT3、TNFα-NFκB、补体、cGAS-STING、NLRP3、UPRmt、ISR、Müller 反应性胶质化、microglia DAM/稳态。重点看 Muller / Microglia / RGC 两组。
图 11：各炎症模块 Δ 分（突变−WT，S1/S2 均值）热图——最亮的红色块是 Müller 反应性胶质化（+0.11）与 microglia DAM（+0.20）；IFN/NLRP3/cGAS 在 Müller 中无上调甚至下降。
| 组 | 反应性胶质化 | 补体 | IFN-α | NLRP3 | cGAS | DAM | 稳态 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Muller | +0.147/+0.069 | +0.039/+0.025 | −0.001/−0.006 | −0.045/−0.047 | −0.022/−0.020 | +0.125/+0.063 | −0.012/−0.012 |
| Microglia* | +0.213/+0.267 | +0.000/−0.068 | +0.002/+0.009 | −0.132/−0.347 | −0.131/−0.125 | +0.114/+0.279 | −0.340/−0.812 |
（*Microglia WT 仅 8 核，深度差 2 倍，仅方向性参考。）
核心结论：Müller 反应性胶质化是 P1 最稳健的炎症信号。它由 Gfap/Vim/Serpina3n/Apoe/Lcn2/Clu 等驱动，方向明确（两样本一致上调），且不受深度 confounder 影响（模块分已校正）。补体仅微升，IFN/cGAS/NLRP3 无激活——说明该模型的胶质炎症走的是反应性胶质化 + 微补体路径，而非 I 型 IFN 或 NLRP3 炎症小体主导。
Microglia 的 DAM 上调 + 稳态下调方向符合"激活"，但 WT 基数太小，唯一能穿透深度差的证据是 Apoe 检出率 0.125 → 0.629（突变低深度反而检出更高，方向逆深度，可信）——即小胶质在突变中进入 Apoe+ DAM 样状态。
图 12：Müller 反应性胶质化 / 补体 / IFN-α 模块分布（按样本分面）——Müller 反应性胶质化在突变两样本整体右移（红/橙虚线上方），IFN-α 三组几乎重叠（无激活）。
4.1 GSEA prerank（Hallmark）——正式富集分析
方法：pseudobulk 一致性 LFC 排序列表 → gseapy.prerank，MSigDB Hallmark（小鼠 50 条，min_size=15，1000 次置换）。作者只用 Reactome/WikiPathways、未用 Hallmark，故此步是相对作者的增量（Reactome 富集直接以作者 S3–S12 交叉）。
| 通路 | Müller | RGC2-like | RGC1-like |
|---|---|---|---|
| TNF-α/NF-κB | −2.09 (0.002) | +1.17 (ns) | +0.89 (ns) |
| Inflammatory Response | −1.64 (0.06) | +0.98 (ns) | +1.11 (ns) |
| IFN-α Response | −1.25 (ns) | +0.77 (ns) | +0.73 (ns) |
| Oxidative Phosphorylation | +1.93 (0.003) | +0.53 (ns) | +2.34 (<10⁻³) |
| Glycolysis | +1.00 (ns) | +0.80 (ns) | +1.29 (0.22) |
| ROS Pathway | −0.77 (ns) | +0.76 (ns) | +1.92 (0.003) |
| Myc Targets V1 | +1.83 (0.003) | +0.54 (ns) | +1.54 (0.10) |
图 12b：三组 Hallmark GSEA 的 NES 条形图——Müller（蓝）在免疫炎症通路（TNF-α/NF-κB、Inflammatory、IFN、IL2-STAT5）上负富集，在 OXPHOS/Myc/mTORC1 上正富集；RGC1-like（粉）在 OXPHOS/ROS/糖酵解上强正富集；RGC2-like（红）无显著富集。
GSEA 结论（与模块打分完全自洽，并进一步收窄 H2）：
- Müller 的经典炎症通路是"负富集"而非激活：TNF-α/NF-κB NES −2.09（FDR 0.002）、Inflammatory Response −1.64、IFN-α/γ 均负——Müller 的"反应性胶质化"不是 NF-κB/IFN 经典炎症，而是 OXPHOS +1.93、Myc +1.83、mTORC1 +1.52 的代谢重编程（与 §1 的 ETC 上调一致）。
- RGC1-like 的代谢代偿/氧化应激强富集：OXPHOS +2.34（FDR<10⁻³）、ROS +1.92、糖酵解 +1.29——与模块分"RGC1-like 各模块上调"互证，提示该群处于代偿/应激状态。
- RGC2-like 无显著富集（WT 7 核功效不足），但其代谢下调已由模块分（−0.30）与 pseudobulk 基因级 LFC（−0.70）确证。
5. P1-⑤ ISG 逐基因核查 + P1-⑥ 全局转录鉴别（联合回答 H2）
ISG 逐基因：RGC2-like 中 Ifit2 −2.57/−1.03、Cmpk2 −3.98/−2.45、Rtp4 −2.57/−2.57——确实强下调，与作者一致。但 ISG 整体 vs 全基因背景不显著低于背景（p=0.16），且 housekeeping 基因中位数同样下降（−0.50）：
图 13：RGC2-like 中 ISG（红）与 housekeeping（蓝）的 LFC 分布相对全基因背景（灰）——ISG 与 HK 一起整体左移，说明是全局性下调的一部分，不是 IFN 通路的特异抑制。
图 13b：IFN–JAK–STAT 通路逐基因 LFC 热图（pseudobulk 均值）——RGC2-like/RGC1-like 两列普遍为负（Ifit2/Ifitm3/Cmpk2/Stat1 下调），Müller 列同样以负为主（Jak1/Stat1/Ifit2 下调）——三类细胞均无 ISG 上调，印证"IFN 通路整体未激活"。
图 13c：microglia 的 IFN 基因检出率差（Δdet = 突变−WT，WT 仅 8 核、深度差 2 倍，仅方向性）——IFN 通路基因（Jak1/Stat1/Stat3 等）检出率差为负或近零，同样无一致上调。
全局转录鉴别（Step 5.5）三条证据：
图 14：A——每核检出基因数比值（突变/WT ≈0.5），但这被 §0 的"WT 非杆核深度 2 倍"污染；B——深度校正后的 housekeeping 模块分：突变无塌陷，多数细胞类型反而略升（+0.05~+0.13）；C——pseudobulk UP/DOWN 比全部 >1（突变上调占优）。
结论：该模型不存在"无差别的全局转录塌陷"，但存在"基础程序的结构化下调"。 A 面板的"突变基因数减半"是 WT 非杆核深度异常的假象（B 面板深度校正后消失）；作者 RGC-2"1171 下调 vs 2 上调"的极端全下调偏斜在我们数据中未复现（我们 RGC2-like 是 1748 UP vs 1391 DOWN，上调更多）。但 pseudobulk 基因级层面，代谢基因（ETC −0.70、糖酵解 −0.44）与 housekeeping 基因（中位 −0.50）相对整体确实下调——这是"能量危机下关停昂贵基础程序"的结构化改变，而非深度 artifact 的无差别全下调。
因此 RGC 的 ISG 下调应解读为：与代谢基因、管家基因一起的"基础程序"相对下调（能量危机的转录特征），而非 IFN 通路特异激活/抑制。真正的炎症信号在胶质侧（Müller 反应性胶质化、microglia DAM），不在 RGC 本体。
6. 对研究假设的回应（P0+P1 综合）
- H1（代谢直接受损）：✅ 完整复现。签名法锁定真正 RGC-2 后，ETC（−0.30）、CI biogenesis（−0.28）、糖酵解（−0.72）、线粒体自噬全部下调，pseudobulk 基因级 ETC 中位 log2FC 达 −0.70——作者的"Complex I/ETC/糖酵解协同下调"核心结论完整复现；Müller 的 ETC 上调经下采样裁决为真（+0.10），但其余"代谢全面上调"被否决。
- H2（炎症轴）：✅ 有方向性证据，但路径收窄、且经典炎症不升反降。Müller 反应性胶质化（最稳健）+ microglia DAM 转换（Apoe↑）+ 补体微升；I 型 IFN/JAK-STAT、cGAS-STING、NLRP3 均无激活，且 Hallmark GSEA 显示 Müller 的 TNF-α/NF-κB（NES −2.09）、Inflammatory Response（−1.64）显著负富集——Müller 的"激活"是代谢重编程（OXPHOS/Myc/mTORC1 上调），不是经典炎症激活。作者表中"IFN 富集"经证是通路名误导（真 ISG 是全局下调的一部分，非特异激活）。
- 机制链条（更新版）：OPA1 缺陷 → RGC 能量危机（糖酵解代偿失败，H1 直接打击，且伴整体转录活力下降）→ Müller 反应性胶质化 + microglia 进入 DAM 状态（H2，胶质主导的慢性炎症/胶质增生）→ 可能的继发神经元损伤。胶质炎症是 RGC 能量危机的下游响应，而非 IFN 抗病毒式炎症。
7. 已知局限（P1 新增）
- WT 深度 confounder：WT 非杆核深度是突变 2 倍，所有检出率比较不可靠（已改用模块分 + median-of-ratios LFC）。
- RGC2-like WT 仅 7 核、microglia WT 仅 8 核：这两组的一切结论都是方向性，无统计功效（按第三轮裁决分别接受为"最保守下界"与"支持性线索"）。
- pseudobulk 无正式 P 值（WT n=1），方向一致性 + S1/S2 阴性校准是无奈之选。
- RGC-2 签名法固有低估（疾病下调的身份基因使突变"较健康"细胞才被分类为 RGC2-like）。
- microglia DAM 结论依赖逆深度 Apoe 检出率 + 8 核的模块分，最弱。
- score_genes 对照校正的方法坑：在"基础程序整体下调"背景下，
score_genes的对照基因（同表达量 bin 随机基因）也会下调，导致真实下调被抵消——P0 的"ETC 持平"即由此产生，改用 pseudobulk 基因级 LFC 后 ETC 才显现 −0.70。教训：涉及全局偏移的比较须交叉用"对照校正模块分"与"pseudobulk 基因级 LFC"两种口径。
8. 下一步（P2 建议，第三轮裁决已定优先级）
- （已完成）修订 P0/P1 报告：补 ETC/CI 完整复现、修正 Müller 下采样表述、写入第三轮裁决。
- liana 细胞通讯（Step 8，P2 首选）：Müller↔RGC↔microglia 的炎症配受体（补体 C3-C3aR、Apoe-Trem2/Lrp1、Spp1 轴），为"胶质炎症→神经元损伤"提供旁证。
- Müller 反应性胶质化深挖：Gfap/Serpina3n 的细胞亚群异质性（是否存在"反应性 Müller 亚群"），与 ETC 上调是否同一群。
- cellbender：已裁决不启动（两阶段终止；深度而非 ambient 是主要 confounder，多 marker 门控已规避 ambient，无 GPU 成本高）。
- confounder 加固：追查 WT 非杆核深度 2 倍的根本原因（GEO reads/建库细节），不阻塞结论。
- 若空转数据（Visium HD）后续可得，做空间验证（搁置中）。